多因素干预促进视神经再生的实验研究及视神经缺血模型的建立

【摘要】青光眼、外伤性、缺血性视神经病变、视神经炎等是目前世界范围内的主要致盲性眼病,临床上尚无根治这类疾病的方法,最根本的原因就在于视神经轴突缺乏有效的再生能力,损伤后很难修复。如何有效的保护视网膜神经元,促进其轴突再生,维持并改善视功能,是目前眼科乃至神经科学亟待解决的难题。本研究一方面在目前视神经再生研究的基础上,联合拮抗多种抑制损伤轴突再生的内在、外在因素,从而更有效的促进了损伤轴突再生；另一方面,建立了新型大鼠后部缺血性视神经病变的动物模型,为深入研究该疾病奠定了基础亦为视神经再生的研究提供了新的且更符合生理损伤过程的视神经病变模型。第一部分联合拮抗多种抑制轴突生长的内在和外在因素促进损伤视神经轴突再生目的：视神经轴突损伤后再生能力受到众多外在和内在因素的共同调控。本研究旨在通过联合干预多种抑制轴突生长的内、外在因素,促进损伤视神经轴突再生。方法：成年大鼠玻璃体腔注射多种AAV8Y733F-shRNA病毒下调RGCs内KLF9、KLF13、KLF16、KLF2、KLF5、KLF15或PTEN的表达。AAV2-Cre玻璃体腔注射分别敲除PTENfl/fl小鼠、KLF4fl/fl小鼠以及PTENfl/fl&KLF4fl/fl小鼠RGCs内PTEN和／或KLF4基因,并且通过玻璃体腔注射AAV2-C3抑制RGCs内RhoA的活性,拮抗微环境中多种抑制损伤轴突再生的因子。荧光金上丘逆标RGCs,视网膜铺片计数比较视神经损伤后各组RGCs存活率。荧光霍乱毒素B亚单位顺行标记再生轴突,视神经纵行切片在损伤位点后不同距离计数再生轴突数量。结果：与对照组相比,同时下调RGCs内KLF2、KLF5和KLF15的表达后,能够显著提高RGCs的存活率达50%以上。KLF9、KLF13和KLF16同时下调组与PTEN下调组RGCs也显示出了与KLF2、5、15下调组相似的保护作用,并且各组再生轴突数量亦较对照组显著增多,但再生轴突大部分局限在距离挫伤位点1mm以内。条件性敲除小鼠RGCs内PTEN基因,能够显著促进视神经再生,而KLF4的条件性敲除却对损伤视神经轴突再生无明显的促进作用,且PTEN与KLF4双基因敲除对轴突的促进作用与PTEN单基因敲除相似。联合应用C3阻断RhoA的活性后,各组轴突再生的数量和长度均有所增加,尤其以PTEN的敲除和C3联合应用组再生轴突的数量最多,并且最长的再生轴突能够延伸到挫伤位点后4mm。结论：联合下调KLFs家族多种抑制RGCs轴突生长的转录因子对视神经损伤后RGCs有保护作用并且能在一定程度上促进损伤视神经轴突的再生。与KLF4发育性敲除不同,成年小鼠条件性敲除RGCs内KLF4并不能促进损伤视神经轴突再生。而同时拮抗轴突再生的外在抑制因素(C3的应用)和提高RGCs轴突自身的生长能力(PTEN的敲除)则能够更有效的促进损伤视神经轴突的再生。第二部分新型大鼠后部缺血性视神经病变模型的建立目的：建立大鼠后部缺血性视神经病变的动物模型,并且观察视网膜和视神经在该动物模型中的病理生理改变以及神经营养因子对视神经缺血性病变后视网膜神经节细胞的保护作用。方法：通过光化学反应诱导缺血性损伤(Photochemical-inducedischemia)建立大鼠后部缺血性视神经病变的动物模型。高分子量荧光右旋糖昔心脏灌注观察视网膜、视神经的血供情况。损伤后不同时点视神经切片,HE染色观察损伤部位病理改变,免疫组化染色观察星形胶质细胞及小胶质细胞／巨噬细胞的活化情况。上丘逆标视网膜神经节细胞计数观察损伤后RGCs死亡的时间和空间分布,以及神经营养因子对RGCs的保护作用。结果：视神经缺血损伤后,损伤局部血管渗漏,组织水肿并最终导致轴突空泡样变性。缺血灶局部星形胶质细胞丢失而病灶周边部则表现为肥大。小胶质细胞／巨噬细胞首先在损伤局部活化,随后迁移到远端视神经乃至视交叉部位。缺血损伤后视网膜神经节细胞随着时间的推移逐渐减少,在损伤后1周、2周和3周分别减少23%,50%和70%,并且不同品系大鼠RGCs减少的空间分布不同,或为全网膜的广泛减少或局限于上方视网膜,与轴突在网膜内的空间分布不同有关。BDNF和CNTF的多次应用能够有效的保护RGCs,至损伤后3周,能提高RGCs存活率达40%以上。结论：我们通过PCI方法成功建立了大鼠后部缺血性视神经病变的动物模型,此模型中视网膜及视神经在缺血损伤后所表现出的病理生理改变与临床PION病人的病变过程很相似。这一大鼠后部缺血性视神经病变模型不仅为进一步深入研究PION疾病乃至其他中枢神经系统缺血性疾病的发病机理、分子生物学改变及药物干预奠定了基础。而且其作为一种更符合生理损伤过程的视神经病变模型,可以被进一步优化用于视神经再生领域的研究。
【作者】王艳；
【导师】孙兴怀；
【作者基本信息】复旦大学，眼科学，2012，博士
【关键词】视神经；再生；KLFs；PTEN；C3缺血；动物模型；视网膜神经节细胞；存活；炎症反应；神经营养因子；PCI；

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